细胞的复苏成败与冻存及复苏操作息息相关。上周，我们分享了关于细胞冻存过程中常见错误的细节，详见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇文章主要从复苏的角度分析并排查复苏过程中可能出现的问题。

首先，我们先复习一下复苏步骤：

复苏步骤

1. 提前将水浴锅预热至37℃，准备好培养基并设置离心机转速。
2. 准备一个15ml的离心管，并加入适量的培养基。
3. 取出冻存管，迅速浸入水浴锅并摇晃，使细胞在2分钟内充分融化。
4. 慢慢将细胞悬液滴入已加培养基的离心管中，进行1000rpm离心3分钟。
5. 弃去上清液，重悬细胞并接种至培养器皿中，放入培养箱。

复苏过程中常见的错误操作

1. 若液氮或冰箱距离水浴锅较远，且未采取保冷措施，细胞可能在运输过程中开始融化（特别是在夏季），冻存细胞应放在干冰或冰盒上运输至水浴锅。

2. 运输冻存管时若手接触到细胞部分或将其放入口袋，请勿用手触碰冻存管身，以防局部温度升高导致细胞开始融化。应捏住管盖运输或将其置于容器内。

3. 融化细胞时采用错误的方法，不应用手捂化（搓热也不行），因手心温度不足，导致细胞受热不均匀且降温速度过慢，最终导致细胞死亡。

4. 水浴时若没有严格控制时间，直接将冻存管放入水中静置而未进行摇晃，可能会减缓细胞复苏的效率。复苏需遵循“快融”原则，建议在2分钟内完成融化，水浴时间过长将降低细胞活率。最佳方法是捏住管盖，将管身浸入水中快速摇晃，以促进细胞的融化。切忌将冻存管静置在水浴中。

5. 水浴结束时若管内仍有较大冰块未融化，会导致细胞死亡。一方面，冰块中的细胞温度缓慢升高而死亡，另一方面，冰块会对已经融化的细胞造成低温损伤。有些同学反映2分钟的水浴时间难以完全融化细胞，建议将水浴锅温度提高至39度（亲测可行），并加快摇晃速度。若担心污染，可将冻存管放入一次性PE手套内再实施水浴。值得注意的是，水浴锅中的水不能过少，以确保冻存管放入后能达到预设温度。

6. 细胞融化后未进行离心以去除DMSO。有些同学在复苏细胞后直接将10倍培养基稀释，不离心直接培养，等细胞贴壁后再换液。虽然对于易于培养的贴壁细胞，这种做法在短期内可行，但不是长远之计，并且不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞有一定毒性，某些细胞（如HL-60细胞）对DMSO特别敏感。因此，如果不确定自己的细胞是否对DMSO敏感，离心去除上清将更为安全。

以上内容是基于小尚多年的经验总结，结合冻存篇，希望能够帮助解决绝大多数复苏失败的问题。如果还有其他未提及的知识点，欢迎大家在评论区补充。同时，通过尊龙凯时的优质产品与服务，确保您的细胞复苏过程更加顺畅、成功。